Un equipo de investigadores en Instituto Federal Suizo de Tecnología Desarrolló un microscopio de conducción iónica de barrido (SICM) de alto rendimiento utilizando los últimos avances en nanoposicionamiento, nanofabricación, microelectrónica e ingeniería de control.
Haber de imagen: Shutterstock.com/ Meletios Verras
El escaneo resuelto en el tiempo permite la visualización en 3D de estructuras dinámicas en la membrana de la célula eucariota a una resolución nanométrica.
Estudiar las funciones de las células vivas y los orgánulos a nanoescala es vital para comprender las causas de las enfermedades. Los métodos convencionales, incluida la microscopía electrónica, desafortunadamente, pueden dañar estas células.
Investigadores suizos han desarrollado un microscopio SCIM que resuelve procesos 3D espacial y temporalmente diversos en la membrana de una célula eucariota con una resolución axial de menos de 5 nm. Esto puede proporcionar información sobre las interacciones dentro de las células para combatir infecciones y enfermedades.
Fundamentos de la microscopía de sonda
Estudiar las funciones complejas de las células vivas a nanoescala es un desafío único. Los investigadores han desarrollado una variedad de tecnologías para enfrentar este desafío, incluida la microscopía de fuerza atómica (AFM), la microscopía de túnel (STM) y la sonda fotoeléctrica (SPE).
La microscopía de sonda (SPM) forma imágenes de superficies con una sonda que escanea la muestra. Esta tecnología apareció por primera vez en 1981 en forma de un microscopio de efecto túnel, que produce imágenes con resolución atómica al escanear una muestra con una sonda.
En los microscopios de barrido, los actuadores piezoeléctricos mueven la sonda con precisión a un nivel atómico controlado por la electrónica. La sonda puntual escanea la muestra. Captura los puntos de datos discretos que se utilizan para componer una imagen. Su método de escaneo se llama modo.
La microscopía de conducción iónica (SICM) fue desarrollada por PK Hansma y sus colegas en la Universidad de California en 1989. Un medio acuoso que contiene electrolitos es un mal conductor.
Un microscopio SCIM escanea una nanonda (micropipeta con una apertura de 50 a 100 nm) cerca de la superficie de la muestra. A medida que la sonda se mueve a través de la muestra, las corrientes iónicas fluyen a través de la pipeta. La fuerza de estas corrientes varía según la resistencia eléctrica a través de la superficie de la muestra y, por lo tanto, revela información sobre su composición.
Sin embargo, en el modo de salto descrito por el equipo suizo, la nanoprobe no se escanea mediante escaneo de trama. Se mueve verticalmente hacia arriba y hacia abajo en un movimiento de salto.
La sonda se acerca a la muestra a una distancia de 25 a 50 nm en puntos específicos y se retrae, proporcionando puntos de medición separados a partir de los cuales se forma la imagen. Fundamentalmente, la sonda nunca toca la muestra, evitando así daños a la muestra.
Por lo tanto, la microscopía SCIM es una herramienta poderosa para capturar cambios agudos en la topografía celular sin afectar la muestra.
Microscopía de conducción iónica de barrido con resolución temporal
Los microscopios SICM de resolución temporal producen perfiles de alta resolución de formas celulares y propiedades superficiales. Sin embargo, estos deben correlacionarse con la información bioquímica y los cambios en la organización interna de las células.
El equipo suizo ha integrado un microscopio óptico invertido en un microscopio SICM, lo que les permite incorporar técnicas de microscopía de ultra resolución recientemente desarrolladas en su enfoque.
La configuración del SICM consiste en un disparador Z de pipeta de diseño personalizado (disparador vertical) incrustado en un dispositivo de atmósfera controlada, que es fundamental para la viabilidad celular durante la obtención de imágenes.
La obtención de imágenes de células eucariotas requiere actuadores piezoeléctricos de largo alcance (> 10 – 20 μm). Esto conduce a una compensación entre la frecuencia de resonancia y el rango del operador. El equipo superó esto reduciendo de forma adaptativa la velocidad de la pipeta y aplicando una ganancia al movimiento piezoeléctrico en función de la curva de reacción actual.
El operador Z logró una amplificación mecánica de amplio desplazamiento de un rango de barrido de 22 μm en la superficie de la celda. Fue impulsado por un controlador piezoeléctrico hecho a medida integrado con una etapa de motor paso a paso para el enfoque de muestra.
El equipo utilizó nanopipetas de borosilicato y cuarzo para sondear. Fabricado con dióxido de carbono.2 Extractor láser con un radio de 20 a 60 nm. Los capilares de cuarzo se encogieron a un radio de menos de 10 nm usando irradiación con haz de electrones.
Muchos procesos celulares ocurren en escalas de tiempo de minutos u horas y se pueden rastrear fácilmente usando SICM de lapso de tiempo. Sin embargo, los procesos subcelulares, como la endocitosis celular o la infección, ocurren más rápidamente. La tecnología del equipo suizo combina la capacidad de procesar imágenes de gran tamaño (hasta 220.000 µm).3) relativamente rápido utilizando imágenes SICM de alta velocidad de pequeños detalles en células vivas.
Amplia gama de medidas posibles (tamaños de escaneo de 500 x 500 nm2 hasta 100 x 100 µm2, velocidades de disparo de 0,5 seg / foto a 20 min / foto; El número de píxeles por imagen de 1 Kp a 1 Mp; La profundidad de visión (22 µm con resolución axial de menos de 10 nm) mejora significativamente la gama de estudios biológicos facilitados por la microscopía SICM.
Referencias y lecturas adicionales
Leitao, S., et al., (2021) Microscopía de conducción iónica de barrido por tiempo limitado para el seguimiento 3D de la dinámica de la superficie celular a nanoescala. ACS nanoY [online] Disponible en: https://doi.org/10.1021/acsnano.1c05202
Liu, B., et al., (2013) Ensayo de microscopía de conducción iónica: una nanotecnología para estudios biológicos en células vivas. Fronteras en fisiologíaY [online] 3. Disponible en: https://doi.org/10.3389/fphys.2012.00483
